Translation

The Ribosome

蛋白質合成的兩個參與者，mRNA和aa-tRNA，和一個適當的引領者，且使生成的鏈不會折疊，ribosome正好兩者都可以辦到。E. coli中大約有15,000個ribosome。所以一個細胞中提供大部分的能量來生成ribosome和並用它們合成蛋白質。

原核生物的ribosome的深澱係數為70S，分子量為2.3x16¹⁶D。它們由兩個部分組成，分別是30S和50S。每一個都是由一特殊的rRNA和蛋白質共同構成。在E. coli中，30S單位由16S rRNA加21個不同的蛋白質，標定為S1，S21。50S單位包括了兩個rRNA-23rRNA和5S rRNA加上31個不同的蛋白質，標定為L。所有的ribosome protein可利用SDS gel分離出來。

原核生物中一個有作用的ribosome，在蛋白質合成位置，含有約50個蛋白質和3個不同的rRNA分子。

Internal Structure of the Ribosome

Cross-linking, neutron scattering, immunoelectron microscopy, and cryoeletron microscopy研究出ribosome的細微構造。

Ribosome Assembly

僅管ribosome的構造複雜，但它們的次單位仍然可在in vitro合成。

The mechanisms of translation

Tanslation包含了三個步驟：initiation, elongation, and termination。每個步驟有特殊的蛋白質幫助(IFs, Efs, and RFs)

起始步驟產生了70S initiation complex。它組成mRNA與ribosome，再抓入tRNA。一開始，mRNA和tRNA與30S subunit結合，然後50S加入，整體構造形成。mRNA和tRNA與30S結合需要initiation factors的幫助(IF1, IF2, IF3)。IF3和IF1的出現，使70S的結構分開，產生一個free 30S。接著GTP-IF2-initiator tRNA結合上30S，此時，30S initiation complex完成！ (30S_IF3, IF1+mRNA+GTP-IF2-initiator tRNA)，這個complex對50S有高親合性，並與50S結合，伴隨著IF3離開。

Initiator tRNA可辨識AUG，通常是產生methionine, 但實際上是帶著N-formylamethionine。

30S與mRAN結合在5'一個特殊位置上-Shine-Dalgarno sequence，在16S rRNA的3'端，可與mRNA的序列形成配對。rRNA上3'－UCCUCC－5'可與所有的SD sequence配對。

Ribosome有三個供tRNA結合的位置：P(peptidyl) site, A(aminoacyl) site，和E(exit) site。Initiator tRNA是與P site結合，此時IF2上的GTP水解成IF2-GDP, Pi，接著和IF1一起釋出，開始進行elongation。

Elongation

Polypeptide的延長是一種循環的模式。在cycle的一開始，新生的polypeptide chain接到tRNA上(in the P site)，而A和E site是空著的，和mRNA排一起的A site等待攜著下一個aa的tRNA進入。Elongation factor EF-Tu也帶著GTP。當tRNA進入A區，GTP水解，然後EF-Tu GDP被放出。校對工作發生在這個步驟。EF-Tu-GTP可由其他的cycle再產生。當tRNA進入A區後，在GTP水解的前後皆會被檢查，如果錯誤，就被丟掉。

接下來，決定性的步驟：peptide bond的形成。在P site上的polypeptide chain轉到A site上的tRNA，稱為：Peptidyl transfer，需要的酵素為：peptidyltransferase，位在50S上。新的研究指出，一些ribosomal RNA可能是enzymatic complex的一部分，ribosomal RNA扮演著ribozyme的角色。

不帶aa的tRNA移到E區，在A區，帶著新生的polypeptide chain的tRNA一起移到P site。這個步驟中，ribosome也朝mRNA 3'端移動了３個nucleotide，露出空白的A site。這個步驟需要protein factor (EF-G)-GTP，並伴隨著GTP的水解。舊的tRNA由E site移出。

完整的循環為：

1. polypeptide是一個個延長的。
2. ribosome 在mRNA上一次移動3個nucleotide(一個codon)
3. 最後，共有兩個GTP被水解。

所有的步驟一再的重覆，直到終止訊號出現。

Termination

Polypeptide的合成結束於Stop codon(UAA, UAG, UGA)移到A site時。因為在正常的環境下，沒有tRNA可辨識這幾個codon。Release factor參與了終止的過程。在原核生物中發現了三種RF. 其中兩種可在stop codon占據A site時與ribosome結合。RF1辨識UAA和UAG，RF2辨識UAA和UGA。RF3是一種GTPase，經過binding和水解的過程，可刺激ealease的過程。

Stop codon也可和rRNA特殊的序列相互作用，間接幫助RF。

當RF1或RF2和ribosome結合後，peptidyltransferase將C-terminal由P-site RNA移給水，peptide chain由ribosome移出。接著RF和GDP也跟著release。此時70S ribosome不穩定，受到了IF1和IF3作用，ribosome立即分離為50S和30S，為下一個translation準備。

當ribosome次單位分離，30S不一定會和mRNA分離。有些例子為polycistronic，30S會直接滑到下一個SD sequence，起始密碼進入，開始一個新的轉譯循環。如果30S分離了，它會很快地再與另一條結合。

suppression of mutations

Nonsense mutation是指原本可做出蛋白質的codon發生突變，變成stop codon，因此這段peptide在成熟前就終止了。使突變基因回復並不容易，但是使其他的基因產生突變，也浦可以抑制nonsense mutaion。當第二個突變發生在其他基因上時，我們稱此現象為intergenic suppression。例如第一個突變發生在mRNA上，使轉譯終止，但部分的tRNA的anticodon位置突變，可辨識stop codon，轉譯可繼續進行。所以，致死突變也可被類似的突變抑制。

The Inhibition of Translation by Antibiotics

Antibiotic會干擾蛋白質的合成。

Penicillin抑制細菌細胞壁的合成，gramicidin和valinomycin干擾膜內外離子通透的平衡。Translation複雜的過程，是抗生素喜愛的目標。一些抗生素作用的機制對原核和真核有很大的不同，因此人類可安心使用這些抗生素，因為它們無法通過細胞膜。

但對微生物使用抗生素的問題，在於它們可能對這些抗生素產生抵抗力。因為他們得到了抗藥基因(resistance gene)，一個重要的例子就是Erythromycin resistance。Erythromycin在ribosome的23S RNA上有特殊的位置。這個抗生素可被一種酵素甲基化上一個特別的adenine→抗生素被抑制。實驗證明，擁有帶有可產生methylase基因plasmid的細菌，可在有erythromycin的培養基中存活。

干擾蛋白質合成的抗生素

• Tetracycline:四環黴素。抑制aa-tRNA與ribosome結合，阻斷translation
• Streptomycin：鏈黴素。干擾aa-tRNA與codon的結合，或是錯誤的配對，產生不正常的蛋白質。
• Erythromycin:紅黴素。與23S特殊位置結合，干擾轉譯步驟，阻斷elongation
• Chlorampheniol:綠黴素。阻斷elongation與peptidyltransferase有競爭性抑制。
• Puromycin:嘌呤黴素。使完成前的peptide終止。結構其中一部分與aa-tRNA的3'端相似，可進入A site.

Rate and energetics of translation

原核生物轉錄和轉譯的速度幾乎一樣快。

E. coli有15,000個ribosome，所以每次可產生每個約300 residue protein 750個。

轉譯十分耗能，每加上一個aa，需要4個ATP。

The final stage in protein synthesis: folding and covalent modification

Chain folding

在translation的過程中，蛋白質就開始折疊，translation完成時，折疊也近乎完成。在第六章提到，自動折疊的功能，會被chaperone protein阻斷或延遲。

原核的N-fMet，是利用deformylase移除。推測N-fMet對蛋白質具有折疊和保護的功用。

Translation時立即伴隨著folding、共價修飾、運輸。

可穿透膜的細菌蛋白，在N端具有疏水的signal sequence(leader sequence)。SecB是一種chaperone，防止未成熟的polypeptide由膜孔穿出。膜上具有SecY, SecE，是一種transmembrane protein。另外還有SecA，是一種ATPase，驅動polypeptide移出膜外。當pro-protein移出後，leader sequence被membrane-bound protease切斷。此時，protein可以折疊了！(切的位置 常是一些小的aa，如Glysine, Alanine)

The regulation of protein synthesis in prokaryotes

大致上，蛋白質合成的控制常發生在transcription level。如果要減少蛋白質，通常是關閉轉錄的基因(會耗能)，但有些是在translation level。

在translation作調控的理由：

1. 在轉譯開始前停止，可避免能量損耗。
2. mRNA和ribosome間有很多位置可以block。

在轉譯起始時的三個調控機制：

1. mRNA形成三級結構，使30S無法結合。此法用於polycistronic的調節。如:MS2(噬菌體)，含有A protein、coat protein、replicase subunit、and L protein。如果5'折疊，第一個A protein無法轉譯出來，ribosome會直接找下一個起始點。replicase可催化病毒自己的mRNA replication，複製新的plus strain，尚未折疊時，可和ribosome結合，產生A protein。之後又折疊起來。其中L protein與coat protein有重疊的部分，自己形成另一個reading frame。
2. 特殊蛋白質與mRNA結合，阻斷動作開始。原核的ribosome 由polycistronic message產生。其中一種可與5'結合，阻斷轉譯。在原核中，極度缺乏aa時，會造成ppGpp和pppGpp的累積，抑制rRNA的產生。
3. Antisense RNA。位於3'端的序列(不能coding)和5'端序列為互補序列，轉錄成mRNA時，產生folding，雙股的現象。防止translation進行。利用antisense RNA阻斷translation可應用於疾病的治療，可能可用於治療癌症上。利用RNA作為治療的困難在於將RNA送入細胞中，因為帶負電的物質較難通過膜。