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The Ribosome编辑

蛋白質合成的兩個參與者,mRNA和aa-tRNA,和一個適當的引領者,且使生成的鏈不會折疊,ribosome正好兩者都可以辦到。E. coli中大約有15,000個ribosome。所以一個細胞中提供大部分的能量來生成ribosome和並用它們合成蛋白質。

原核生物的ribosome的深澱係數為70S,分子量為2.3x1616D。它們由兩個部分組成,分別是30S和50S。每一個都是由一特殊的rRNA和蛋白質共同構成。在E. coli中,30S單位由16S rRNA加21個不同的蛋白質,標定為S1,S21。50S單位包括了兩個rRNA-23rRNA和5S rRNA加上31個不同的蛋白質,標定為L。所有的ribosome protein可利用SDS gel分離出來。

原核生物中一個有作用的ribosome,在蛋白質合成位置,含有約50個蛋白質和3個不同的rRNA分子。

Internal Structure of the Ribosome编辑

Cross-linking, neutron scattering, immunoelectron microscopy, and cryoeletron microscopy研究出ribosome的細微構造。

Ribosome Assembly编辑

僅管ribosome的構造複雜,但它們的次單位仍然可在in vitro合成。

The mechanisms of translation编辑

Tanslation包含了三個步驟:initiation, elongation, and termination。每個步驟有特殊的蛋白質幫助(IFs, Efs, and RFs)

起始步驟產生了70S initiation complex。它組成mRNA與ribosome,再抓入tRNA。一開始,mRNA和tRNA與30S subunit結合,然後50S加入,整體構造形成。mRNA和tRNA與30S結合需要initiation factors的幫助(IF1, IF2, IF3)。IF3和IF1的出現,使70S的結構分開,產生一個free 30S。接著GTP-IF2-initiator tRNA結合上30S,此時,30S initiation complex完成! (30S_IF3, IF1+mRNA+GTP-IF2-initiator tRNA),這個complex對50S有高親合性,並與50S結合,伴隨著IF3離開。

Initiator tRNA可辨識AUG,通常是產生methionine, 但實際上是帶著N-formylamethionine。

30S與mRAN結合在5'一個特殊位置上-Shine-Dalgarno sequence,在16S rRNA的3'端,可與mRNA的序列形成配對。rRNA上3'-UCCUCC-5'可與所有的SD sequence配對。

Ribosome有三個供tRNA結合的位置:P(peptidyl) site, A(aminoacyl) site,和E(exit) site。Initiator tRNA是與P site結合,此時IF2上的GTP水解成IF2-GDP, Pi,接著和IF1一起釋出,開始進行elongation。

Elongation编辑

Polypeptide的延長是一種循環的模式。在cycle的一開始,新生的polypeptide chain接到tRNA上(in the P site),而A和E site是空著的,和mRNA排一起的A site等待攜著下一個aa的tRNA進入。Elongation factor EF-Tu也帶著GTP。當tRNA進入A區,GTP水解,然後EF-Tu GDP被放出。校對工作發生在這個步驟。EF-Tu-GTP可由其他的cycle再產生。當tRNA進入A區後,在GTP水解的前後皆會被檢查,如果錯誤,就被丟掉。

接下來,決定性的步驟:peptide bond的形成。在P site上的polypeptide chain轉到A site上的tRNA,稱為:Peptidyl transfer,需要的酵素為:peptidyltransferase,位在50S上。新的研究指出,一些ribosomal RNA可能是enzymatic complex的一部分,ribosomal RNA扮演著ribozyme的角色。

不帶aa的tRNA移到E區,在A區,帶著新生的polypeptide chain的tRNA一起移到P site。這個步驟中,ribosome也朝mRNA 3'端移動了3個nucleotide,露出空白的A site。這個步驟需要protein factor (EF-G)-GTP,並伴隨著GTP的水解。舊的tRNA由E site移出。

完整的循環為:

  1. polypeptide是一個個延長的。
  2. ribosome 在mRNA上一次移動3個nucleotide(一個codon)
  3. 最後,共有兩個GTP被水解。

所有的步驟一再的重覆,直到終止訊號出現。

Termination编辑

Polypeptide的合成結束於Stop codon(UAA, UAG, UGA)移到A site時。因為在正常的環境下,沒有tRNA可辨識這幾個codon。Release factor參與了終止的過程。在原核生物中發現了三種RF. 其中兩種可在stop codon占據A site時與ribosome結合。RF1辨識UAA和UAG,RF2辨識UAA和UGA。RF3是一種GTPase,經過binding和水解的過程,可刺激ealease的過程。

Stop codon也可和rRNA特殊的序列相互作用,間接幫助RF。

當RF1或RF2和ribosome結合後,peptidyltransferase將C-terminal由P-site RNA移給水,peptide chain由ribosome移出。接著RF和GDP也跟著release。此時70S ribosome不穩定,受到了IF1和IF3作用,ribosome立即分離為50S和30S,為下一個translation準備。

當ribosome次單位分離,30S不一定會和mRNA分離。有些例子為polycistronic,30S會直接滑到下一個SD sequence,起始密碼進入,開始一個新的轉譯循環。如果30S分離了,它會很快地再與另一條結合。

suppression of mutations编辑

Nonsense mutation是指原本可做出蛋白質的codon發生突變,變成stop codon,因此這段peptide在成熟前就終止了。使突變基因回復並不容易,但是使其他的基因產生突變,也浦可以抑制nonsense mutaion。當第二個突變發生在其他基因上時,我們稱此現象為intergenic suppression。例如第一個突變發生在mRNA上,使轉譯終止,但部分的tRNA的anticodon位置突變,可辨識stop codon,轉譯可繼續進行。所以,致死突變也可被類似的突變抑制。

The Inhibition of Translation by Antibiotics编辑

Antibiotic會干擾蛋白質的合成。

Penicillin抑制細菌細胞壁的合成,gramicidin和valinomycin干擾膜內外離子通透的平衡。Translation複雜的過程,是抗生素喜愛的目標。一些抗生素作用的機制對原核和真核有很大的不同,因此人類可安心使用這些抗生素,因為它們無法通過細胞膜。

但對微生物使用抗生素的問題,在於它們可能對這些抗生素產生抵抗力。因為他們得到了抗藥基因(resistance gene),一個重要的例子就是Erythromycin resistance。Erythromycin在ribosome的23S RNA上有特殊的位置。這個抗生素可被一種酵素甲基化上一個特別的adenine→抗生素被抑制。實驗證明,擁有帶有可產生methylase基因plasmid的細菌,可在有erythromycin的培養基中存活。

干擾蛋白質合成的抗生素编辑

  • Tetracycline:四環黴素。抑制aa-tRNA與ribosome結合,阻斷translation
  • Streptomycin:鏈黴素。干擾aa-tRNA與codon的結合,或是錯誤的配對,產生不正常的蛋白質。
  • Erythromycin:紅黴素。與23S特殊位置結合,干擾轉譯步驟,阻斷elongation
  • Chlorampheniol:綠黴素。阻斷elongation與peptidyltransferase有競爭性抑制。
  • Puromycin:嘌呤黴素。使完成前的peptide終止。結構其中一部分與aa-tRNA的3'端相似,可進入A site.

Rate and energetics of translation编辑

原核生物轉錄和轉譯的速度幾乎一樣快。

E. coli有15,000個ribosome,所以每次可產生每個約300 residue protein 750個。

轉譯十分耗能,每加上一個aa,需要4個ATP。

The final stage in protein synthesis: folding and covalent modification编辑

Chain folding编辑

在translation的過程中,蛋白質就開始折疊,translation完成時,折疊也近乎完成。在第六章提到,自動折疊的功能,會被chaperone protein阻斷或延遲。

原核的N-fMet,是利用deformylase移除。推測N-fMet對蛋白質具有折疊和保護的功用。

Translation時立即伴隨著folding、共價修飾、運輸。

可穿透膜的細菌蛋白,在N端具有疏水的signal sequence(leader sequence)。SecB是一種chaperone,防止未成熟的polypeptide由膜孔穿出。膜上具有SecY, SecE,是一種transmembrane protein。另外還有SecA,是一種ATPase,驅動polypeptide移出膜外。當pro-protein移出後,leader sequence被membrane-bound protease切斷。此時,protein可以折疊了!(切的位置 常是一些小的aa,如Glysine, Alanine)

The regulation of protein synthesis in prokaryotes编辑

大致上,蛋白質合成的控制常發生在transcription level。如果要減少蛋白質,通常是關閉轉錄的基因(會耗能),但有些是在translation level。

在translation作調控的理由:

  1. 在轉譯開始前停止,可避免能量損耗。
  2. mRNA和ribosome間有很多位置可以block。

在轉譯起始時的三個調控機制:

  1. mRNA形成三級結構,使30S無法結合。此法用於polycistronic的調節。如:MS2(噬菌體),含有A protein、coat protein、replicase subunit、and L protein。如果5'折疊,第一個A protein無法轉譯出來,ribosome會直接找下一個起始點。replicase可催化病毒自己的mRNA replication,複製新的plus strain,尚未折疊時,可和ribosome結合,產生A protein。之後又折疊起來。其中L protein與coat protein有重疊的部分,自己形成另一個reading frame。
  2. 特殊蛋白質與mRNA結合,阻斷動作開始。原核的ribosome 由polycistronic message產生。其中一種可與5'結合,阻斷轉譯。在原核中,極度缺乏aa時,會造成ppGpp和pppGpp的累積,抑制rRNA的產生。
  3. Antisense RNA。位於3'端的序列(不能coding)和5'端序列為互補序列,轉錄成mRNA時,產生folding,雙股的現象。防止translation進行。利用antisense RNA阻斷translation可應用於疾病的治療,可能可用於治療癌症上。利用RNA作為治療的困難在於將RNA送入細胞中,因為帶負電的物質較難通過膜。

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