Peptidoglycan

Peptidoglycan

革蘭氏陽性菌和陰性菌細胞壁的比較

細菌的表面包有一層細胞壁，細胞壁的主要功能在於維持細菌形狀，並具有保護細菌的功能。此外，細菌的細胞壁也提供一個通透性障壁供特定分子的進出，同時也扮演著細胞與細胞間辨識及吸附的角色。細菌細胞壁所含的主要成分是peptidogylcan，gram positive bacteria和gram negative bacteria細胞壁的組成在結構上有所不同，可依組成結構的不同來分辨兩者，gram negative bacteria所含的 peptidoglycan layer較薄（只有單層），位於outer membrane 和 inner membrane兩層膜之間，然而gram positive bacteria所含的peptidoglycan layer較厚，並堆疊在細胞膜外。

Peptidogylcan是一種多醣的聚合物，其單體主要由N-acetylmuramic acid (NAM)和N-acetylglucosamine (NAG)兩個單醣所組成，兩者以β1→4 (O-link)的方式鍵結，可和其他單體利用相同方式交替相接成精密的長鏈，並再以短鏈的peptide互相串連形成三度空間的立體結構。這些連接用的短鏈peptide group通常是由五個amino acid所組成，與兩個單醣中的NAM相接，五個amino acid依序分別是L-Alanine, D-Glutamate, L-Lysine (或Diaminopimelic acid, DAP)和2 D-Alanine。然而gram positive bacteria和gram negative bacteria在peptide上的組成有所差異，gram positive bacteria短鏈peptide group中所含的第三個amiono acid是DAP，然而gram negative bacteria通常使用L-Lysine。

Gram positive bacteria和gram negative bacteria所含的peptidoglycan layer除了厚度以及連接用的peptide group組成上有所不同外，附著在peptidoglycan上的蛋白質也有所不同。在革蘭氏陽性菌中，其細胞壁中亦含有teichoic acid(台口酸) ，這個teichoic acid是由甘油或是含5個碳的酒精(叫做ribotol)所形成的多聚體(polymer)，通常由5~30個單元所組成，本身會由膜中突出來而連接到peptidoglycan的骨架上。這個互相交錯所形成的共價結構，可被視為包圍在細胞外的一個巨大結構。一般說來，革蘭氏陰性菌的細胞壁有20~40層的peptidoglycan，與lipoprotein組合而成，且其厚度約為50 nm。

Peptidoglycan 的合成

peptidoglycan的合成大致上可分為四個步驟。Peptidoglycan組合的第一步驟是先將sugar變成amino sugar，藉由UDP的活化，使UDP-GlcNAc利於進入Peptidoglycan的合成路徑。Amino sugar進一步變成UDP-NAM。新合成的UDP-NAM依序和三個amino acid組成的peptide連接，再接上D-Ala-D-Ala。NAM-peptide group和膜上的lipid carrier結合，再接上NAG，經由translocation到細胞膜外，再進一步進行polymerization。

Step 1. UDP-amino sugar的合成

形成amino sugar的過程是由fructose-6-P開始，經由Fructose-6-P amidotransferase和glutamine參與，生成glucosamine-6-P。接著Phosphoglucosamine mutase將glucosamine-6-P第六號位置上的磷酸根移到一號碳的位置上，形成glucosamine-1-P，這個步驟為可逆反應。Glucosamine-1-P再利用GlmU syntase使參與反應的acetyl-CoA將其acetyl group轉移到glucosamine-1-P第二個位置上，形成N-acetylglucosamine-1-P。GlmU syntase接著將UTP接到N-acetylglucosamine-1-P的磷酸根的位置上，並放出兩個磷酸根，形成UDP-NAG。

PEP與UDP-NAG作用，接在第三號碳的OH基上，形成phospholactoyl-UDP-GlcNAc，經由MurA transferase作用，使PEP去掉一個磷酸根，形成EP-UDP-GlcNAc，接著NADPH和MurB reductase的參與，使EP-UDP-GlcNAc還原成UDP-NAM。

Step 2. UDP-NAM pentapeptide的合成

活化的UDP-NAM利用MurC、MurD、MurE和MurF依序接上L-Ala、D-Glu、NDP or L-Lys最後接上D-Ala-D-Ala。每一個步驟都會耗掉一個ATP。

然而自然界中的amino acid主要是以L form存在，因此細菌發展出一個特有的酵素—Racemase--可將L form的glutamate轉變成D-glutamate。另一個形成D-glutamate的方式是利用D-amino acid aminotransferase將D-Alanine上的胺基轉到α-keto-glutarate上形成D-glutamate。方程式如下：

D-Alanine +α-keto-glutarate ←→ D-gluamate + pyruvate

Step 3. Translocation

當Peptidoglycan的單元形成後，可接到膜上一個lipid carrier，這個lipid carrier的主要功能就是將接在carrier上的peptidoglycan單元，翻轉至細菌外，再作polymerization，主要有平面和立體的連接方式，平面的連接方式是NAG和NAM間的連接，立體的連接方式則是靠著tetrapeptide和tetrapeptide間的cross linkage。

NAG和NAM間的連結主要靠著MurG (N-acertylglucosaminyl transferase)，NAM-MAG兩兩相連後，釋出的free lipid carrier會進行去磷酸的反應，然後可翻轉回細胞膜內重覆使用。

Step 4. Polymerization and cross linking

Tetrapeptide間的連結主要靠著Mur synthetase，peptide group間的連結是靠著一串glycine相連，一端與第三個amino aicd—L-lys相接，另一端則接在另一個tetrapeptide上第四個amino acid—D-Ala上，第五個D-Alanine被釋出。

應用｜Application

抗生素作用的機制不外乎抑制細菌與生理作用相關構造的合成，可分成下列四種：(1) 抑制細胞壁的合成；(2) 抑制蛋白質的合成；(3) 抑制核酸合成；(4) 改變細胞膜功能。本文僅就抑制細胞壁合成討論之。 能抑制細胞壁合成的抗生素有下列幾類：

• β-lactam antibiotics

這類抗生素都含有一個β-lactam ring的結構，常見的有penicillin and cephalosporins等等。

• Cycloserine:

D-cycloserine結構類似於D-Alanine，它可和形成D-Alanine dipeptide和MurF的substrate binding site作用，防止D-Ala結合到NAM的peptide上。

• Fosfomycin (Phosphonomycin)

在合成的一開始，UDP-NAG變成UDP-NAM的步驟可被phosphnomycin抑制，使UDP-NAM無法合成，因此在Peptidoglycan的組成中便缺少了一個很重要的基本單元，細菌無法形成完整的Peptidoglycan，維持滲透壓的構造被破壞，便容易受外界影響而且打破。

• Vancomycin

vancomycin是一種Transglycosylase抑制劑，可和peptidoglycan單元末端的D-Ala-D-Ala結合，形成五個氫鍵，同時抑制了transpeptidation and transgylcosylation。微生物的應變方式是將D-Ala-D-Ala改為D-Ala-D-lac或D-Ala-D-Ser。當D-Ala-D-Ala變成D-Ala-D-Ser時，氫鍵的作用位置改變或失去，使得兩者間的親合力下降了一千倍。(Walsh, C. Nature 2000)

• Ristocetin

Transglycosylase抑制劑，可和新合成的D-Ala-D-Ala結合。

• Bacitracin

Bacitracin是一種lipid phosphatase抑制劑，可干擾lipid carrier的作用，使lipid carrier交換NAM-NAG之後，無法翻轉回細胞內再利用。

Antibiotics		Target	Mechanism of microbial resistance
β-Lactam antibiotics	Penicillins	Transpeptidases/transglycosylases (PBPs)	β-Lactamases, PBP mutants
	Methicillin
Cycloserine		D-alanine racemase (Alr) and D-alanine:D-alanine ligase (Ddl).
Fosfomycin (Phosphonomycin)		Pyruvyl transferase
Glycopeptides	Vancomycin	D-Ala-D-Ala termini of peptidoglycan and of lipid II	Reprogramming of D-Ala-D-Ala to D-Ala-D-Lac or D-Ala-D-Ser
Ristocetin		Transglycosylase
Bacitracin		Lipid phosphatase

參考資料｜Reference

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