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In vitro kinase assay,意指你要測量的protein是個kinase,需要透過IP的方式把該kinase IP出來,然後在in vitro的方式下加入substrate,以及isotope P32(或是其他label方式),來測試這個kinase是不是有能力去將substrate磷酸化將irradiated P32 label上

實驗方法上可分為兩種: 1. target kinase 會先overexpress,再用anti-tag ab去把protein作IP 優點: 第一,因為protein經過overexpression; 第二,anti-tag ab usually 有較高的 binding efficiency (經驗上,用tag ab去做IP的效果好很多,最起碼IP下來的protein量真的比較多)

2. 直接去用kinase specific ab 把 endogenous kinase IP出來進行後續的實驗 優點: 比較實際表達細胞內該kinase的活性 實驗限制上: 第一,細胞內生性的protein量一定比較少; 第二,抗體作IP的效率也沒有tag ab來的強 (因此作endogenous kinase要讓你IP出來,且要能進行接下來的kinase assay經過數次wash等步驟,是需要足夠的protein量,不然也做不出來)

這兩種方法的使用設計上是有所不同目的: 一個是看上游訊號對kinase活性變化,像cdk在不同cell cycle活性,是常以endo為主; 至於探討kinase活性與不同的mutant construct的差異就幾乎只有overexpress可以選擇 (一般來說除非沒有可IP的抗體,不然只用tag ab來探討kinase activity說服點稍嫌薄弱,畢竟overexpressed protein並非細胞內真實情況,因此最終還是要回到endo的實驗才比較被認同)

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