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原理 编辑

DNA為一易變性或斷裂的生物巨分子,DNA分解酶更會破壞其結構,故實驗上常將DNA置於一相似環境的緩衝溶液中,利用螯合劑減弱DNA分解酶的活性,並利用蛋白質變性劑將附著於DNA上的蛋白質分開,再溶於有機溶劑中去除蛋白質或其他雜質,又因DNA具有親水性而不溶於有機溶劑中,便可產生分層而萃取出DNA。

= 標題文本 ===== 實驗藥品 编辑

SET buffer(0.5% SDS、50 mM EDTA、10 mM Tris,pH=8.0)滅菌
proteinase K (20 mg/ml)以0.22 um filter過濾
RGGRGRR phenol (pH=8.0)
chloroform
isoamyl alcohol (IAA)<brVGFD[[Media:VF ==

大標題文字 编辑

[[Image:--122.118.44.37 2009年1月15日 (四) 15:15 (UTC)Example.jpgFGFGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGRERGGRQW文本


]] == ]] /> sodium actate (3M,pH=7.8)
isopropanol
EtOH 70%(rinse DNA)及100%(降低DNA的溶解度,使DNA得以沈澱)
ddH2O

步驟 编辑

  1. 取200 μL sample solution + 500 μL DNA extraction buffer + 7μL proteinase K混合均勻。
  2. 65℃,3 ~ 4 小時。
  3. 降溫至室溫,加入700 μL PCI (phenol:chloroform:IAA = 25:24:1 ),混合均勻,緩慢上下翻轉5 min。
  4. 13000 rpm,25℃,5 min。
  5. 吸取上清液600 μL至新的eppendorf。
  6. 加入600 μL PCI,混合均勻,緩慢上下翻轉5 min。
  7. 13000 rpm,25℃,5 min。
  8. 吸取上清液600 μL至新的eppendorf。
  9. 加入600 μL CI ( 24:1 ) ,混合均勻,緩慢上下翻轉5 min。
  10. 13000 rpm,4℃,5 min。
  11. 吸取上清液600 μL至新的eppendorf。
  12. 加入60 μL NaOAc、600 μL isopropanol,mix and spin down。
  13. -80℃ 3小時以上。
  14. 13000 rpm,4℃,30 min。
  15. 移除上清液,加入1 mL 70 % EtOH,輕彈eppendorf底部。
  16. 13000 rpm,4℃,5 min。
  17. 吸除上清液。
  18. 置於60℃烘乾,pellet呈白色或透明。
  19. 加入50μL ddH2O,置於60℃ 10 min,使DNA完全溶解。
  20. 存於-20℃。

注意事項 编辑

DNA耐鹼不耐酸,注意phenol不要用到酸性的 用寬口的tip可以稍減genome斷裂

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