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目的 编辑

1. 瞭解單一生物族群生長的情形

2. 熟悉無菌操作


原理 编辑

生物在沒有環境限制因子存在的情況下,是呈現指數生長(exponential growth)。在族群擴充到某一程度後,產生了一些環境現制因子,像是生長空間,食物的獲取和有毒物質的產生,會限制族群的持續增長。本實驗是用大腸桿菌(Escherichia coli)作材料﹔利用E. coli族群增長的情形來觀察生物的增長。

細菌經過一個晚上(大約18小時)的培養後,轉放到新鮮培養液時,需要一段時間來復甦,這個時期叫做Lag phase。接下來細菌呈指數式關係生長,這個時期叫做Log phase,當培養液中的氧氣和營養被消耗掉後,再加上細菌代謝作用中產生的酸,於是細菌族群生長停止,細菌數目呈穩定狀態,這個時期叫做Stationary phase。

培養基的製備:

細菌培養基需提供下列幾種的營養條件,(1)碳源作為能源﹔(2)氮源﹔(3)水份﹔(4)磷﹔(5)硫﹔(6)及其他不同的礦物質,如鐵和鎂。LB是培養E.coli常用的培養基,其主要的成份是酵母菌淬取物(yeast extract),另有一種蛋白質水解物(tryptone) 和鹽(NaCl)。液體培養基是把各個成份溶於水中即可。若加入洋菜膠則成為固體培養基。洋菜膠是固體培養基理想的凝固劑,它具有良好的凝結特性及對大部份的細菌及其他微生物生長不具有營養價值及抑制作用,固體洋菜膠在90-100℃溶解,而在42℃時凝固。

培養基的製備需要經過無菌滅菌消毒,一般將溶解後的培養基(固體培養基需加洋菜膠)放到容器內,在高壓滅菌鍋(Autoclave oven)中,用高溫(121℃)滅菌20分鐘。

實驗藥品 编辑

1.培養基(LB)

2.Cuvette

3.100 mM MgSO4溶液

4.細菌展開用的玻棒

5.三腳錐瓶(flask)

6.培養基平板 (12/組)

7.37℃振盪培養箱(shaker)

8.Vortexer

9.37℃培養箱(incubator)

10.tubes


步驟 编辑

(一) OD600=0.003~0.5

1.取用25 ml LB及菌液 (old stock)

2.取出1 ml LB當作blank (分光光度計歸零用)

3.取出.25 ml菌液加入25 ml LB,並搖晃混合均勻

4.放入37 ℃shaker去振盪培養

5.等30分鐘後,取出1 ml去測OD600

6.之後每隔20分鐘,取出1 ml去測量OD600

7.利用semi-log繪圖紙,劃出細菌的生長曲線

(OD600=Y軸﹔時間=X軸)

OD600=0.3-2.0

1.取用25 ml LB及菌液 (young stock)

2.取出1 ml LB當作blank (分光光度計歸零用)

3.取出0.2 ml 菌液到0.8 ml LB搖晃混合均勻後去測量OD600

4.依菌液的濃度,取適當量的菌液到25 ml LB去,OD600值是在0.15-0.2之間。

5.以下照上面的步驟4至7做。

(二) 1.取出0.1 ml 的菌液放到冰上,作一連串的稀釋用。

OD600=0.003~0.5:在OD600=0.3時取。

OD600=0.3~2.0:在OD600=1.5時取

10-2﹑10-4﹑10-5﹑10-6﹑10-7,(稀釋液是用無菌的10 mM MgSO4溶液)

2.取0.1 ml (10-5~10-7)的稀釋液塗抹到培養基平板上,每一種稀釋度塗兩個平板,並用細菌展開玻棒將菌液均勻展開。

3.放入37 ℃incubator,隔日(經過12-18小時後)來數菌落數目。

應用 编辑

目前產業有針對最近測量細菌的生長曲線,開發出一款「非接觸式濁度計」(OD moniter),換句話說即是不需要使用分光光度計,即可直接測量OD600,改進傳統操作方法,節省不少人力。

測量原理的連結

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