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原理编辑

2-D electrophoresis乃是利用每個蛋白質具有不同的PI值及分子量以達到分離的目的。

2DE是利用兩次電泳將蛋白質分離,第一次電泳是依蛋白質的帶電量來分離,第二次電泳是而用蛋白質分子量的不同分離蛋白質。將膠上的蛋白質染色後,可由染色的深淺推斷蛋白質間的比例。若要一一辨別蛋白質的身份,則可交給質譜儀來完成。

目的编辑

  1. 比較不同染色法之間的靈敏度,本次實驗所用到的染色法有:coomassie blue stain、silver stain、ruby stain。
  2. 比較factor VIII deficient plasma及normal plasma之間蛋白質的表現有何不同。

實驗器材编辑

步驟编辑

  1. IEF
  2. 2D-PAGE electrophorsis
  3. Ruby stain
  4. Typhoon scan
  5. Image master data analysis

討論编辑

  • 為何跑IEF時電壓停在5000 volt左右就上不去?
sample準備過程中,鹽濃度太低可能使導電性變差,鹽濃度太高則使蛋白質的溶解度降低,鹽析的結果阻塞住孔洞,使導電性變差,因此電壓無法上升。
實驗過程中的水蒸氣凝結成的水,可能會影響電壓上升,可以將水擦乾後繼續進行實驗。
  • 為何2-D電泳上看不見marker?
一般prestain marker較難用Ruby染色出來。loading的量不足,也可能使coomassie blue stain的marker沒有出現
  • 以2DE分析蛋白質仍有一些缺點:(i) 以細胞萃取物來說,仍然有很多蛋白質無法有效分離出來;(ii) transmembrane protein 的分離仍有很大的問題;(iii) 在膠上的一個點,可能包含了不只一種蛋白質,而同種的蛋白質也可能因為修飾作用而位在不同的位置;(iv) 因此在蛋白質的分析上,還需結合定序的資料庫;(v) 最後還需要技術熟練的人員。

相關實驗方法编辑

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