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以下內容由PTT的blot所分享,原文發表於2004年10月2日,Biotech板。描述的實驗方法背景為斑馬魚卵顯微注射。


顯微注射法 (Microinjection)是一種利用玻璃毛細管將DNA注入胚胎細胞的技術。

而電破法 (Electroporation) 則是利用瞬間高電壓,使細胞膜孔隙張大,而DNA則得以進入。


毛細管針的製備 编辑

  • 拉針--利用重力及加熱金屬環把毛細管從中間拉開

重力越大,溫度越低,所拉的針越細長;

重力越小,溫度越高,所拉的針越粗短。

  • 拉針器:
拉針的機器可分為兩種:直立式和水平式
直立式所拉的針,上下兩根針的粗細長短會有所差別,受G的影響,水平式所拉的針,左右兩根針則會相同。
可是,一般最常用的還是直立式拉針器,因為直立式的一台10萬元左右,水平式的一台起碼30萬元。
  • 磨針--由於拉完針後,針尖端會受熱融合,保持封閉,因此需要利用磨針器來將針尖磨開。

磨針時可加水流,以避免碎削堵住針尖。

磨的角度越小,或是開口越小,越易刺入卵中;但是相對的容易堵針。

磨的角度越大,或是開口越大,越亦對卵造成傷害;但是相對的不用常常換針。

小技巧

比較好的做法是,盡可能磨小一點,而DNA乾淨一點,針保存乾淨一點。這是需要花時間去取得最適當的開口的。

有些人會在磨完針後,利用針筒注入礦物油,利用空氣壓縮力大於液體壓縮力的原理,以求得比較精準的注射量。但是須注意不能有氣泡,否則會在抽取DNA時造成負壓。

也有人是不加入礦物油,但是還是會在水中清洗針頭。

不管用哪一種方式,針頭保持乾淨是一定要的,不然等到你要注射時就會發現連續好多根針都是堵針的,到時候就哭笑不得了。

附註一點,我記得打老鼠的針不是用磨的,而是用敲開的,這就非常需要技巧了,因為每次敲開的大小很容易不一樣,需要特別注意。但是我不是注射老鼠的,不是太清楚。

DNA製備 编辑

再來製備DNA就是很簡單的事了,只要注意用水去溶解DNA,以免造成毒性。還有,切plasmid時,可以切一刀,以便增加插入染色體的機率。在這一部分就屬於轉基因的原理,在此不多說了。

注射 编辑

注射的機器其實有很多種,有氣壓式,油壓式,也有手動式。那是需要花時間去適應的。

由於我只打過斑馬魚卵,我只敘述斑馬魚卵的打法。

注射時DNA需加入phenol red,這是一種染劑,可以在DNA注射進去時用肉眼看到,以便確定有注射進去。因為DNA是透明的嘛,如果注射到細胞的部分,是看不到DNA的。

小技巧

注射時若是打到卵殼間,DNA會快速擴散,若是打到卵黃囊或是細胞,則會聚集,慢慢擴散。

注射時多半會打入細胞中,效果較佳。有時也會打入卵黃囊,這是比較好打,但是通常是打入有毒性物質時。

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