原理[ | ]
此種染色法由丹麥微生物學家Hans Christian Gram 於西元1884 年所創， 是最常用的細菌鑑別染色法。步驟如下：
1.初染劑：初染劑乃結晶紫，使細菌染成紫藍色。
2.媒染劑：乃革蘭氏碘液，可與初染劑結合而形成不溶性複合物。所形成之結晶 紫-碘（CV-I）複合體藉以加強染料顏色，此時所有細菌均成紫黑色。
3.脫色劑（Decoloring agent）：乃95%乙醇，此試劑具有脂溶性（lipid solvent） 與蛋白質脫水劑之雙重功能。其作用依微生物細胞壁所含脂肪濃度而定。[[格蘭氏 陽性菌]]之脂質含量低且細胞壁具有厚層之汰聚醣，乃保留CV-I 複合體之主要因 素，因少量之脂質經乙醇作用，立刻溶解，形成細胞壁之細孔，但此細孔隨即因 乙醇之脫水作用而封閉，以致緊密結合之初染劑不易移去，終於保留紫色。[[革蘭 氏陰性菌]]細胞壁中之外層含高量之脂質，易為乙醇溶解，形成大孔。即使引起細 胞壁蛋白之脫水也不易封閉該孔，因此有利於未結合CV-I 複合體之釋出，致使 菌體成無色。
4.複染劑：最後試劑為番紅，凡經上述脫色之細菌，被此染料染成紅色。因僅革 蘭氏陰性菌發生脫色，故於此步驟能吸收複染劑。革蘭氏陽性菌則保留初染時之 紫色。
革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的比較
__性 質_______________革蘭氏陽性菌___________革蘭氏陰性菌_____________
1.染色結果_____________仍維持紫色____________由紫色變為紅色____________
2.細胞壁組成________脂質含量較少(1-4%)_____脂質含量較多(11-22%)________
3.細胞壁結構______單層，且較厚(15-80 nm)___三層，且較薄(10-15 nm)______
4.對鹼液的抵抗力_____不溶於 10% KOH 中______可溶於 10% KOH 中__________
5.孢子之產生______________常見__________________ 少見________________
6.對物理狀況之抵抗力________大_____________________小_________________
7.營養需求____________多數都較複雜_______________需求簡單______________
8.常見的菌種_______大多數的球菌和產孢桿菌_________非產孢桿菌_____________
實驗器材與藥品[ | ]
1.光學顯微鏡
2.0.1M 磷酸緩衝液
3.大腸桿菌(E.coli)
4.結晶紫(crystal violet)
5.碘液
6.95%酒精
7.沙黃或番紅溶液(safranin solution)
8.牙籤
步驟[ | ]
(一)抹片製備
1. 載玻片先用清潔劑洗淨浸泡於95%酒精中
2. 取純系化的單離細菌接種(E .coli)至LB 培養液中，經18 小時增殖後。
3. 取菌液均勻分散於載玻片上，可快速在酒精燈上加熱一下。
(二)染色
1.將塗抹覆以結晶紫，靜置一分鐘。
2.以蒸餾水輕洗。
3.覆以革蘭氏碘液媒染劑，靜置一分鐘。
4.以蒸餾水輕洗。
5.以95%乙醇脫色，勿脫色過度，逐滴滴下，至發現結晶紫未自塗抹中釋出為度。
6.以蒸餾水輕洗。
7.以番紅或沙黃複染45 秒。
8. 以蒸餾水輕洗。
9.以吸水紙吸乾，並用油鏡觀察
注意事項[ | ]
1.染色時，脫色步驟可影響抹片之製備成敗與否。切記脫色過渡時可使初染流 失，使革蘭氏陽性菌成革蘭氏陰性菌。但脫色不足，則不能完全除去CV-I 複合 物，結果是革蘭氏陰性菌成革蘭氏陽性菌。
2.將玻片以蒸餾水充分輕洗，以除去剩餘之染液。
3.宜使用未超過24 小時之新鮮培養，置備抹片。因菌齡老化，尤以革蘭氏陽性 菌易失去保留初染之能力，而顯示革蘭氏易變性。此時，部份菌體染呈紫色。