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原理 编辑

此種染色法由丹麥微生物學家Hans Christian Gram 於西元1884 年所創, 是最常用的細菌鑑別染色法。步驟如下:

1.初染劑:初染劑乃結晶紫,使細菌染成紫藍色。

2.媒染劑:乃革蘭氏碘液,可與初染劑結合而形成不溶性複合物。所形成之結晶 紫-碘(CV-I)複合體藉以加強染料顏色,此時所有細菌均成紫黑色。

3.脫色劑(Decoloring agent):乃95%乙醇,此試劑具有脂溶性(lipid solvent) 與蛋白質脫水劑之雙重功能。其作用依微生物細胞壁所含脂肪濃度而定。[[格蘭氏 陽性菌]]之脂質含量低且細胞壁具有厚層之汰聚醣,乃保留CV-I 複合體之主要因 素,因少量之脂質經乙醇作用,立刻溶解,形成細胞壁之細孔,但此細孔隨即因 乙醇之脫水作用而封閉,以致緊密結合之初染劑不易移去,終於保留紫色。[[革蘭 氏陰性菌]]細胞壁中之外層含高量之脂質,易為乙醇溶解,形成大孔。即使引起細 胞壁蛋白之脫水也不易封閉該孔,因此有利於未結合CV-I 複合體之釋出,致使 菌體成無色。

4.複染劑:最後試劑為番紅,凡經上述脫色之細菌,被此染料染成紅色。因僅革 蘭氏陰性菌發生脫色,故於此步驟能吸收複染劑。革蘭氏陽性菌則保留初染時之 紫色。


革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的比較

__性 質_______________革蘭氏陽性菌___________革蘭氏陰性菌_____________

1.染色結果_____________仍維持紫色____________由紫色變為紅色____________

2.細胞壁組成________脂質含量較少(1-4%)_____脂質含量較多(11-22%)________

3.細胞壁結構______單層,且較厚(15-80 nm)___三層,且較薄(10-15 nm)______

4.對鹼液的抵抗力_____不溶於 10% KOH 中______可溶於 10% KOH 中__________

5.孢子之產生______________常見__________________ 少見________________

6.對物理狀況之抵抗力________大_____________________小_________________

7.營養需求____________多數都較複雜_______________需求簡單______________

8.常見的菌種_______大多數的球菌和產孢桿菌_________非產孢桿菌_____________

實驗器材與藥品 编辑

1.光學顯微鏡

2.0.1M 磷酸緩衝液

3.大腸桿菌(E.coli)

4.結晶紫(crystal violet)

5.碘液

6.95%酒精

7.沙黃或番紅溶液(safranin solution)

8.牙籤

步驟 编辑

(一)抹片製備

1. 載玻片先用清潔劑洗淨浸泡於95%酒精中

2. 取純系化的單離細菌接種(E .coli)至LB 培養液中,經18 小時增殖後。

3. 取菌液均勻分散於載玻片上,可快速在酒精燈上加熱一下。

(二)染色

1.將塗抹覆以結晶紫,靜置一分鐘。

2.以蒸餾水輕洗。

3.覆以革蘭氏碘液媒染劑,靜置一分鐘。

4.以蒸餾水輕洗。

5.以95%乙醇脫色,勿脫色過度,逐滴滴下,至發現結晶紫未自塗抹中釋出為度。

6.以蒸餾水輕洗。

7.以番紅或沙黃複染45 秒。

8. 以蒸餾水輕洗。

9.以吸水紙吸乾,並用油鏡觀察


注意事項 编辑

1.染色時,脫色步驟可影響抹片之製備成敗與否。切記脫色過渡時可使初染流 失,使革蘭氏陽性菌成革蘭氏陰性菌。但脫色不足,則不能完全除去CV-I 複合 物,結果是革蘭氏陰性菌成革蘭氏陽性菌。

2.將玻片以蒸餾水充分輕洗,以除去剩餘之染液。

3.宜使用未超過24 小時之新鮮培養,置備抹片。因菌齡老化,尤以革蘭氏陽性 菌易失去保留初染之能力,而顯示革蘭氏易變性。此時,部份菌體染呈紫色。

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