限制酶實驗

限制酶實驗(restriction enzyme digestion)和純化(elution)方法。

原理｜Principle

Restriction Enzyme：利用限制酶可辨識特殊位置並切開的特性，將plasmid切開，以利於接入其他的片段。

電泳：電泳是利用DNA帶負電的原理，在電場中依分子大小分離，藉此了解核酸的特性

藥劑與儀器｜Reagent and equipment

• 電泳膠：Agarose gel (0.3～2%)
• EtBr
• Maker：1kb
• Dye（0.25% bromophenol blue，0.25% xylene cyanol FE， 15% Ficoll）
• 電泳槽
• 1X TAE buffer
• Restriction Enzyme (以Bsu36I為例)

實驗步驟

1. 在管中加入21μl水，3μl 10X buffer，3μl 10X BSA，2μl pC9-p82-neo，最後加入1μl Bsu36I，總體績為30μl，置於37℃下2小時。
2. elution: 以電泳檢查所要的DNA片段，並在UV下，沿片段切下，加入3倍體積的QG buffer，置於50℃水浴槽中10分鐘，此時顏色變黃。再加入1倍體積的isopropenol，並將溶液收集於spin column中，離心10000rpm, 1分鐘。加入750μl PE buffer，以10000rpm離心1分鐘，兩次。再以14000rpm離心1分鐘，最後加入50μl二次水，並接於1.5μl tube上，靜置1分鐘，以14000rpm離心1分鐘。取4μl跑電泳check。

關於限制酶｜Restriction Enzyme

• 酵素的活性受到溫度的影響，平常保存在低溫之中。實驗過程，enzyme最好最後再加入，以免酵素的活性降低。
• Plasmid上具有許多可供限制酶辨識的位置。 DNA經由限制酶作用之後，有三種情形：blunt end、5’ overhang、3’ overhang。5’ overhang可經由5’→3’ polymerase 將其修補為 blunt end；3’ overhang 可經由3’→5’ exonuclease ，切為blunt end。

討論｜Discussion

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