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限制酶實驗
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限制酶實驗(restriction enzyme digestion)和純化(elution)方法。 ==原理|Principle== Restriction Enzyme:利用限制酶可辨識特殊位置並切開的特性,將plasmid切開,以利於接入其他的片段。 電泳:電泳是利用DNA帶負電的原理,在電場中依分子大小分離,藉此了解核酸的特性 ==藥劑與儀器|Reagent and equipment== *電泳膠:Agarose gel (0.3~2%) *[[EtBr]] *Maker:1kb *Dye(0.25% bromophenol blue,0.25% xylene cyanol FE, 15% Ficoll) *電泳槽 *1X TAE buffer *Restriction Enzyme (以Bsu36I為例) ==實驗步驟== #在管中加入21μl水,3μl 10X buffer,3μl 10X BSA,2μl pC9-p82-neo,最後加入1μl Bsu36I,總體績為30μl,置於37℃下2小時。 #elution: 以電泳檢查所要的DNA片段,並在UV下,沿片段切下,加入3倍體積的QG buffer,置於50℃水浴槽中10分鐘,此時顏色變黃。再加入1倍體積的isopropenol,並將溶液收集於spin column中,離心10000rpm, 1分鐘。加入750μl PE buffer,以10000rpm離心1分鐘,兩次。再以14000rpm離心1分鐘,最後加入50μl二次水,並接於1.5μl tube上,靜置1分鐘,以14000rpm離心1分鐘。取4μl跑電泳check。 ==關於限制酶|Restriction Enzyme== *酵素的活性受到溫度的影響,平常保存在低溫之中。實驗過程,enzyme最好最後再加入,以免酵素的活性降低。 *Plasmid上具有許多可供限制酶辨識的位置。 DNA經由限制酶作用之後,有三種情形:blunt end、5’ overhang、3’ overhang。5’ overhang可經由5’→3’ polymerase 將其修補為 [[blunt end]];3’ [[overhang]] 可經由3’→5’ exonuclease ,切為blunt end。 ===限制酶用量計算方式=== ==討論|Discussion== {| style="border: 1px solid #c9c9ff; background-color: #f3f3ff; color:black;" width="100%" cellpadding="10px" |- valign="top" |<div class="plainlinks" style="float:right;vertical-align: middle; text-align:center; background-color:lightgray; border:2px outset #ccc; padding: 0 .4em;font-size:100%;"> ''' [http://zh.tv.wikia.com/index.php?title=Talk:{{PAGENAME}}&action=edit§ion=new 我要留言]''' </div> |} [[category:實驗]]
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