FANDOM


限制酶實驗(restriction enzyme digestion)和純化(elution)方法。

原理|Principle编辑

Restriction Enzyme:利用限制酶可辨識特殊位置並切開的特性,將plasmid切開,以利於接入其他的片段。

電泳:電泳是利用DNA帶負電的原理,在電場中依分子大小分離,藉此了解核酸的特性

藥劑與儀器|Reagent and equipment编辑

  • 電泳膠:Agarose gel (0.3~2%)
  • EtBr
  • Maker:1kb
  • Dye(0.25% bromophenol blue,0.25% xylene cyanol FE, 15% Ficoll)
  • 電泳槽
  • 1X TAE buffer
  • Restriction Enzyme (以Bsu36I為例)

實驗步驟编辑

  1. 在管中加入21μl水,3μl 10X buffer,3μl 10X BSA,2μl pC9-p82-neo,最後加入1μl Bsu36I,總體績為30μl,置於37℃下2小時。
  2. elution: 以電泳檢查所要的DNA片段,並在UV下,沿片段切下,加入3倍體積的QG buffer,置於50℃水浴槽中10分鐘,此時顏色變黃。再加入1倍體積的isopropenol,並將溶液收集於spin column中,離心10000rpm, 1分鐘。加入750μl PE buffer,以10000rpm離心1分鐘,兩次。再以14000rpm離心1分鐘,最後加入50μl二次水,並接於1.5μl tube上,靜置1分鐘,以14000rpm離心1分鐘。取4μl跑電泳check。


關於限制酶|Restriction Enzyme编辑

  • 酵素的活性受到溫度的影響,平常保存在低溫之中。實驗過程,enzyme最好最後再加入,以免酵素的活性降低。
  • Plasmid上具有許多可供限制酶辨識的位置。 DNA經由限制酶作用之後,有三種情形:blunt end、5’ overhang、3’ overhang。5’ overhang可經由5’→3’ polymerase 將其修補為 blunt end;3’ overhang 可經由3’→5’ exonuclease ,切為blunt end。

限制酶用量計算方式编辑

討論|Discussion编辑


您使用了广告屏蔽软件!


Wikia通过广告运营为用户提供免费的服务。我们对用户通过嵌入广告屏蔽软件访问网站进行了使用调整。

如果您使用了广告屏蔽软件,将无法使用我们的服务。请您移除广告屏蔽软件,以确保页面正常加载。

查看其他FANDOM

随机维基