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學習如何將DNA送入哺乳動物細胞(Transfection),並由此細胞中萃取蛋白質,學習蛋白質定量,並用SDS-PAGE將蛋白質分離,並轉印至NC paper上,用ECL顯影。

原理|Principle编辑

本實驗的設計在於利用重組質體DNA transfect進入細胞來表現或生產蛋白質, 蛋白質經純化,以SDS-PAGE分離後,膠片浸入轉印緩衝液,蛋白質可被轉印到硝化纖維紙(nitrocellulose membrane)上,再利用抗體(antibody)進行免疫染色(immunostaining)。


藥劑和器材|Reagent and equipment 编辑

  • 細胞株
  • RPMI1640 medium:細胞培養液
  • Lipofectin: lipofectin是一種合成的脂質多元體,它可在生理食鹽溶液下與細胞膜融合,這樣的融合可使得DNA順利進入細胞。
  • pSG-5 vector:
pUSF-1:將USF-1接入pSG-5 vector中。USF-1全名upstream stimulatory factor-1,產生的aa 有43kDa是一種transcription factor, 可辨識CANNTG—E box。有bHLH需形成dimer才能與E box結合。
  • Bio-Rad protein assay: 正確名稱為Bradford Method。CBG (CoomassieBrilliant Blue G-250)有點像指示劑,會在不同的酸鹼度下變色;在酸性下是茶色,在中性下為藍色。當 CBG 接到蛋白質上去的時候,因為蛋白質會提供 CBG 一個較為中性的環境,因此會變成藍色。當樣本中的蛋白質越多,吸到蛋白質上的 CBG 也多,藍色也會增強。因此以OD595nm測其吸光值時,藍色的呈色強度,是與樣本中的蛋白質量成正比。
  • Western blot: 免疫染色是利用抗體來偵測轉印紙上面的抗原蛋白質, 最早的放射線免疫呈色,但現在都改用酵素,並且使所產生的生成物為水不溶性,以便把呈色堆積在轉印紙上。

實驗步驟编辑

說明编辑

討論|Discussion编辑


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