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原理 编辑

少量製備質體DNA,在基因選殖(gene cloning) 是一個不可或缺的步驟,利用快速製備質體DNA,經過鑑識酵素(restriction enzyme)消化作用,電泳分析後,可以很快的篩選出許多轉形的品系(clone)。以便找出有興趣或是預期的品系,再利用大量製備法,把DNA大量製備出來,作下一步的實驗。

目前,有許多的方法可以快速製備少量質體DNA,下列兩種方法是實驗室常用的方法﹔快速沸騰法(Holmes和Quigley, 1981)和鹼性溶製法(Birmboim和Doly, 1979)。近年來重組DNA的技術日新月異,有許多廠商以發展出各種不同的色層分析法,去製備質體DNA,比上述的方法省時而且DNA的品質亦比較好。

實驗器材與藥品 编辑

1.微量離心管

2.微量離心機

3.phenol/chloroform (1:1)

4.Isopropanol

5.Soln. I [50 mM glucose, 25mM Tris-HCl pH8.0和10mM ethylene diamine tetra acetate (EDTA)]

6.Soln. II [0.2 N NaOH和 1% sodium dodecyl sulfate (SDS)]

7.Soln. III (3M potassium acetate , pH4.8)

8.STET buffer (8% Sucrose, 5% Triton X-100, 50 mM EDTA and 50 mM Tris-HCl, pH 8.0)

9.Lysozyme

10.70%及95% ethanol


步驟 编辑

鹼性溶製法

1.取1.5ml的菌液放到1.5ml的微量離心管。

2.離心30秒。

3.丟棄上清液,加入50ul的Soln. I。

4.用Vortex振盪將菌體完全混合。

5.加入100ul的Soln. II緩慢的搖晃試管幾次,並靜置於冰浴中5分鐘。

6.加入75ul的Soln. III緩慢的搖晃試管幾次,並靜置於冰浴中5分鐘。

7.離心10分鐘(13000rpm)小心的取上層液到新的微量離心管內。

8.加入100ul的phenol上下倒置10次之後稍微離心一下。

9.加入100ul的chloroform上下倒置約100次離心5分鐘。

10.將上層的水溶液小心的取出放到新的試管內。

11.加入200ul的isopropanol搖動幾次靜置於室溫10分鐘。

12.離心15分鐘,倒掉isopropanol留下pellet。

13.用500ml的70%酒精洗,除去酒精後讓離心管斜躺在桌面上,讓DNA pellet乾燥。

快速沸騰法

1.取1.5ml的菌液放到1.5ml的微量離心管

2.離心30秒。

3.丟棄上清液,加入200ul的STET /lysozyme 溶液。

4.用Vortex振盪將菌體完全混合。

5.將含有細菌的微量離心管放入沸水中煮40秒。

6.在室溫下離心10分鐘。

7.下列步驟參考鹼性溶製法步驟8到13。

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