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原理 编辑

鑑識核酸內切酵素(Restriction endonucleases)為一種特別的酵素,它們對雙股DNA中核甘酸順序的認知具有專一性,此專一性在生物技術上一種很重要的工具。在自然界中,原核生物細胞中的鑑識/修飾系統中,它能把侵入細菌細胞的外來DNA切掉(如噬菌體),但不會切 "保護" 或甲基化的寄主DNA。

鑑識酵素可重覆地認知一種順序,且很準確的在一點上切DNA,一般來說不同的酵素會認知長4-8等不同的核甘酸序列。很多酵素能在他們認知的序列中,將對稱的二軸交互的切開。這種交互切口會使DNA片段的3'和5' 懸空成sticky end,也會與由同一酵素切出來的DNA片段黏接配對而成重組分子。另外一種酵素也會在對稱軸上將認知位置切開,結果產生一種blunt end,這些產物可與其他酵素產生的blunt end DNA片斷黏接。

本實驗介紹瓊脂糖膠(agarose gel)電泳(electrophoresis)。把瓊脂糖融解成溶液再冷卻後,瓊脂糖會以氫鍵形成凝膠。DNA經鑑識切成的片段,放進瓊脂糖膠內,在電場影響下DNA分子會在瓊脂糖膠內移動,帶負電荷的DNA分子會向陽極移動。移動速度依分子大小而定,分子愈大移動性愈慢。凝膠中瓊脂糖的濃度決定了空隙大小,因此,大小不同的DNA片段在不同濃度的凝膠移動速率均不同。

0.8%(w/v) 瓊脂糖膠適用於分離大小為0.5-l0.0 kb的線狀DNA分子,其解析和凝膠濃度有關的,因此在電泳前必須選擇一個能有效地分開DNA分子的凝膠濃度﹔電泳後,凝膠經螢光染劑(ethidium bromide)染色,在UV照射下,可顯示肉眼可見的band(一個DNA片段在凝膠上的位置)。用已知長度的DNA片段如/HindIII DNA做標誌,DNA分子在膠內移動的距離和標誌DNA片段之大小來作一標準曲線,再利用這個曲線和未知的DNA片段在凝膠內的移動距離去比對(內插法),它的長度就可以被決定出來。

在瓊脂糖膠上也可以測定DNA之純度和完整性。由CsCl密度梯度中抽取質體band時,大量製備的DNA樣本可能被RNA及蛋白污染。而小量製備的DNA也因純化DNA的方法較溫和而可能被污染。被RNA污染的位置會使在低分子量之DNA band模糊不清。質體DNA被蛋白質污染時會抑制鑑識酵素的活性,使消化作用較不完全。因而DNA band在凝膠上的移動性較低(移動較近的距離),甚至在nuclease污染情行形下會把質體DNA完全消化掉,可用酚/氯彷(Phenol/chloroform)萃取,再用乙醇沈澱作用把蛋白質及nuclease除去。

在重組DNA技術中,鑑識酵素和電泳被用來鑑定質體DNA的正確性,換言之,一個質體DNA經鑑識酵素消化及電泳後,DNA片斷在凝膠內的模式是否和已知的圖譜相吻合,由此可以辨別這個質體是否正確。

本實驗將利用鑑識酵素和瓊脂糖膠迷你電泳系統作為快速診斷的工具,以測定在前一實驗質體DNA純化實驗中,所製備的質體DNA(plasmid A﹑B﹑和C),並利用DNA片斷段模式來排列鑑識圖譜(restriction enzyme map)中鑑識酵素位置的順序。


實驗器材與藥品 编辑

1.瓊脂糖 (agarose)

2.鑑識酵素

3.DNA marker

4.Pharmacia Image System

5.10x RE緩衝液 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl and 1 mM EDTA)

6.迷你電泳系統

7.電源供應器

8.1 x TAE緩衝液 (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.3)

9.微波爐


步驟 编辑

一﹑質體DNA以鑑識酵素消化的步驟

1.加30ul的TE將純化好的質體DNA溶出來。

2.找出決定要用的鑑識脢所需之最適合的反應溶液。

3.參考下列的組成去做質體DNA/鑑識脢的反應。

tubes 1 2 3

DNA 2ul 2ul 2ul

10X RE buffer 1ul 1ul 1ul

H2O 6.5ul 6.5ul 6ul

鑑識脢 RE1 RE2 RE1+RE2


  • 每一種加0.5ul到各管去

3. 放到37 ℃水槽去,讓鑑識脢去切DNA,反應進行一個小時

二﹑電泳分析

1. 準備0.8% agarose

a. 量0.8g agarose,放到一個玻璃容器內 b. 加入100 ml 1x TAE緩衝液 c. 用微波爐把agarose煮溶,將agarose搖勻。 d. 放到45 ℃的恒溫水槽讓agarose的溫度降低以免太熱,造成電泳平板的變形

2. 將膠倒入電泳平板上,並立刻插入梳板(comb) 註:若有氣泡產生,用藥杓或是吸管把氣泡移除

3. 讓膠在室溫下完全凝固(約二十分鐘)

4. 把膠放入電泳槽中,再倒入1x TAE緩衝液(剛好蓋過agarose gel)

5. 將DNA樣品從從37 ℃水槽中取出加入2ul 6倍的追蹤染劑溶液輕敲管壁,讓追蹤染劑溶液和DNA溶液混合均勻。

註: 追蹤染劑溶液內可加入RNase把RNA分子切小,以免無法看到小分子DNA的片段。

6. 放到離心機,離心3秒

7. 用微量吸管將DNA樣品加到膠內的槽(well)中,並記錄樣品的順序,最後把兩個DNA marker放到剩餘的槽中

8. 接上電源線(黑色負極,紅色正極),帶負電的DNA分子往正極移動

9. 電壓設在50-100V

10. 等到bromophanol blue染劑距膠底有1-2 cm

11. 關掉電源,把膠放置於0.5ug/ml ethidium bromide的溶液中,浸10分鐘,偶而搖動一下

12. 把膠轉移到清水中,浸置約10分鐘

13. 照相記錄結果。

14. 用semi-log繪圖紙,將標識DNA和DNA電泳距離作一標準曲線圖,利用此圖決定出各DNA片斷的大小。

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