細菌DNA小量製備

Mini-culture of bacteria isolates

Hihi

原理｜Principle

常用來抽取質體DNA的方法是用alkaline lysis。Solution I 的目的主要是將細面團塊重新懸浮於緩衝液中。Solution II的配方中含有SDS和NaOH。SDS可將細胞溶解，NaOH可使DNA變性。Solution III是由醋酸與鉀鹽所組成，酸的作用在於中和NaOH所造成的鹼性溶液，而鉀鹽可與DNA形成錯合物，而有利於DNA的沉澱。離心後，上層水層所含的質體DNA離心下來後，須再以70%酒精去除鹽類。

以下介紹的為傳統方法，市面上已可購得許多調配好可長期於常溫/低溫保存的試劑。

藥劑和器材｜Reagent and equipment

• PI solution(50mM glucose、25mM Tris-HCl pH 8.0、10mM EDTA pH 8.0)
• PII solution(0.2N NaOH、1% SDS)
• PIII solution(3M potassium acetate、10% glacial acetic acid)

討論｜Discussion

我要留言 說明 本實驗的設計，是利用鹼可使protein和chromosome沉澱，plasmid會溶於水，再離心即可抽出 實驗中必需在低溫下操作的目的是為了使酵素不活化，保護plasmid不被酵素分解。 加入PII 時，切忌用力振盪，以免染色體DNA成小分子片段，而無法與質體DNA分開。 SDS or high pH可以將cells 打破，然後使chromosome DNA保持denatured的狀態，即使鹼基再度配對，也因分子過於龐大，以至於鹼基匆忙配對而形成雜亂無章的曲大分子。而plasmid DNA因分子小，當中和反應時，DNA renature時可很快恢復到原來的鹼基配對方式。 實驗中使用的E.coli 具有ampr ，此基因能產生β-lactamase，可分解ampicillin的β-lactam環。