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Mini-culture of bacteria isolates

Hihi

原理|Principle编辑

常用來抽取質體DNA的方法是用alkaline lysis。Solution I 的目的主要是將細面團塊重新懸浮於緩衝液中。Solution II的配方中含有SDS和NaOH。SDS可將細胞溶解,NaOH可使DNA變性。Solution III是由醋酸與鉀鹽所組成,酸的作用在於中和NaOH所造成的鹼性溶液,而鉀鹽可與DNA形成錯合物,而有利於DNA的沉澱。離心後,上層水層所含的質體DNA離心下來後,須再以70%酒精去除鹽類。

以下介紹的為傳統方法,市面上已可購得許多調配好可長期於常溫/低溫保存的試劑。

藥劑和器材|Reagent and equipment编辑

  • PI solution(50mM glucose、25mM Tris-HCl pH 8.0、10mM EDTA pH 8.0)
  • PII solution(0.2N NaOH、1% SDS)
  • PIII solution(3M potassium acetate、10% glacial acetic acid)

實驗步驟编辑

說明编辑

  1. 本實驗的設計,是利用鹼可使protein和chromosome沉澱,plasmid會溶於水,再離心即可抽出
  2. 實驗中必需在低溫下操作的目的是為了使酵素不活化,保護plasmid不被酵素分解。
  3. 加入PII 時,切忌用力振盪,以免染色體DNA成小分子片段,而無法與質體DNA分開。
  4. SDS or high pH可以將cells 打破,然後使chromosome DNA保持denatured的狀態,即使鹼基再度配對,也因分子過於龐大,以至於鹼基匆忙配對而形成雜亂無章的曲大分子。而plasmid DNA因分子小,當中和反應時,DNA renature時可很快恢復到原來的鹼基配對方式。
  5. 實驗中使用的E.coli 具有ampr ,此基因能產生β-lactamase,可分解ampicillin的β-lactam環。作為selection marker

討論|Discussion编辑


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