目的[ | ]
觀察溫度對酵素活性的影響。
原理[ | ]
背景知識 —真核生物轉錄（transcription）的機制:
酵母菌在無葡萄糖時，而在外的環境有乳糖時，GAL4是酵母菌中促進乳糖代謝基因表現的activator（能增強轉錄效率的轉錄因子），它就被活化了，進而促進乳糖代謝所需的酵素之產生；它包含了DNA結合區域 (DNA-binding domain) 和活化區域 (activation domain)，前者能專一結合一段被命名為UASG (Upstream Activation Sequence) 的序列，後者與其他轉錄因子共同作用，引導轉錄的進行，這種的調控機制和細菌內的lactose operon的調控機制是非常地類似。在此實驗中利用GAL4/UASG來造成基因過量表現，由於它的過量表現，干擾了眼睛正常發育的程序， 因而造成粗糙眼的表現型。許多環境因子影響蛋白質的活性，其中一個因子是溫度，我們操縱培養果蠅的溫度，影響轉錄因子 (transcription factor) GAL4的活性，從而導致基因產物在量上的改變，因此表現型的程度就因溫度的高低而有不同程度的粗糙眼。
本次實驗的基礎是派拉蒙 (Norbert Perrimon) 和布蘭德 (Andrea H. Brand) 在1993年發表的果蠅GAL4/UASG技術。為了將GAL4基因插入果蠅的染色體DNA中，他們利用果蠅基因轉殖技術將GAL4基因送入果蠅的體內，並隨機地插入於染色體不同的位置，造成了許多品系，用加強子偵測 (enhancer detection)的方式（利用GAL4蛋白可以活化UAS-lacZ，在檢測LacZ在哪些組織表現出來），檢測這些帶有GAL4品系後，其中的GAL4基因是在哪些組織內表現出來；他們從各品系中篩選出GAL4基因是受組織特異性增強子 (tissue specific enhancer) 調控的品系，並建立了一個果蠅品系庫，之後，便可選擇適當的果蠅品系，便能將標記基因的表現侷限於特定的時間和組織，例如even-skipped是果蠅的homeotic gene，只在胚胎時期表現，藉本技術將even-skipped表現在幼蟲期的眼睛成蟲盤（eye imaginal disc），如果even-skipped的表現會干擾眼睛成蟲盤的發育，成蟲眼睛就會不正常，進一步分析的結果，可以讓我們判別這基因產物的功能。在後基因體世代，利用果蠅為模式生物(model organism)去了解人類基因功能，我們可以將人類的基因表現在果蠅的體內，若能幹擾果蠅的發育，我們就能進一步地去分析人類基因的功能。
為了觀察轉錄效率改變的情形，我們培養兩個品系的果蠅，其一帶有標記基因 (target gene) 可影響外表型 (phenotype)，其二帶有針對該基因的轉錄因子（tissue specific GAL4 line）。若需要進行實驗，便使兩品系交配而產生子代，並令標記基因已啟動的胚胎在不同溫度下發育，觀察發育環境溫度不同導致的外表型差異，我們由此評估溫度對蛋白質活性造成的影響。
實驗藥品[ | ]
1.果蠅 (GMR-GAL4, UASG-dtlk, w1118)
2.解剖顯微鏡
3.果蠅培養基（已在指管內）
4.棉花棒
5.鑷子
6.麻醉劑 (Triethylamine)
步驟[ | ]
前置作業
1. 兩種virgin females之採集 (UASG-dtlk, w11188)，每天早上十點、下午四點、晚上十點各採集一次破蛹 (pupa) 而出的雌果蠅。區分雌雄果蠅可觀察性梳之有無、腹部體節的顏色，但最容易的分辨方法是觀察腹部末端的形狀，雌果蠅為尖型 (似鋼珠筆的筆尖)、雄果蠅為鈍狀 (似麥克筆的筆頭)，但以觀察雄蠅外性器官為準。需志願者來收集virgin females和作交配。
2. 剛為成蟲的雌果蠅需經過六到八小時才具有交配能力，所以下午四點和晚上十點採集到的雌果蠅為virgin female，而早上十點採集的果蠅則必須經過挑選。
3. 果蠅剛破蛹時，外骨骼不夠堅實，因此形狀是塌扁的細長形，但接著果蠅會吸氣使腹部膨脹，頗具混淆視聽的效果，所以我們用二氧化碳將之麻醉，若它像氣球洩氣般塌掉，則表示外骨骼尚未硬化，是可接受的virgin female；另一個方法是觀察蛹糞，蛹糞是留在其消化到的廢棄物，從腹部的腹面看去有一個黑色的點，這蛹糞會在接下來的時間被排掉，所以保有蛹糞的果蠅亦可視為virgin female。
4. 採集GAL4+雄果蠅，區分方法同step 1。
實驗一
1.兩管已交配完畢的指管，兩組果蠅分別是:
實驗組：3 GAL4+ males × 10 UASG-dtlk females
對照組：3 GAL4+ males × 10 w1118 females
2. （實驗當天）將成蟲換到新的指管，舊管放置在22 ℃培養箱，新管放置在25 ℃培養箱。
3. （第二天）讓果蠅在25℃的環境下產卵一天後，將成蟲換到新的指管，舊管放回25 ℃培養箱，新管放置在29 ℃培養箱。
4. 第四天將29 ℃培養的成蟲倒到集屍瓶。
實驗二
1.七天後取出果蠅培養瓶，將新羽化的成蟲到新的指管裡面不含食物， 用棉花棒沾取麻醉劑Triethylamine，將果蠅培養瓶打開個小縫，插入棉花棒，等待3到5分鐘後，即可開始觀察被麻醉的果蠅，麻醉的有效時間大約是30分鐘到40分鐘。