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目的 编辑

觀察溫度對酵素活性的影響。

原理 编辑

背景知識 —真核生物轉錄(transcription)的機制:

酵母菌在無葡萄糖時,而在外的環境有乳糖時,GAL4是酵母菌中促進乳糖代謝基因表現的activator(能增強轉錄效率的轉錄因子),它就被活化了,進而促進乳糖代謝所需的酵素之產生;它包含了DNA結合區域 (DNA-binding domain) 和活化區域 (activation domain),前者能專一結合一段被命名為UASG (Upstream Activation Sequence) 的序列,後者與其他轉錄因子共同作用,引導轉錄的進行,這種的調控機制和細菌內的lactose operon的調控機制是非常地類似。在此實驗中利用GAL4/UASG來造成基因過量表現,由於它的過量表現,干擾了眼睛正常發育的程序, 因而造成粗糙眼的表現型。許多環境因子影響蛋白質的活性,其中一個因子是溫度,我們操縱培養果蠅的溫度,影響轉錄因子 (transcription factor) GAL4的活性,從而導致基因產物在量上的改變,因此表現型的程度就因溫度的高低而有不同程度的粗糙眼。

本次實驗的基礎是派拉蒙 (Norbert Perrimon) 和布蘭德 (Andrea H. Brand) 在1993年發表的果蠅GAL4/UASG技術。為了將GAL4基因插入果蠅的染色體DNA中,他們利用果蠅基因轉殖技術將GAL4基因送入果蠅的體內,並隨機地插入於染色體不同的位置,造成了許多品系,用加強子偵測 (enhancer detection)的方式(利用GAL4蛋白可以活化UAS-lacZ,在檢測LacZ在哪些組織表現出來),檢測這些帶有GAL4品系後,其中的GAL4基因是在哪些組織內表現出來;他們從各品系中篩選出GAL4基因是受組織特異性增強子 (tissue specific enhancer) 調控的品系,並建立了一個果蠅品系庫,之後,便可選擇適當的果蠅品系,便能將標記基因的表現侷限於特定的時間和組織,例如even-skipped是果蠅的homeotic gene,只在胚胎時期表現,藉本技術將even-skipped表現在幼蟲期的眼睛成蟲盤(eye imaginal disc),如果even-skipped的表現會干擾眼睛成蟲盤的發育,成蟲眼睛就會不正常,進一步分析的結果,可以讓我們判別這基因產物的功能。在後基因體世代,利用果蠅為模式生物(model organism)去了解人類基因功能,我們可以將人類的基因表現在果蠅的體內,若能干擾果蠅的發育,我們就能進一步地去分析人類基因的功能。

為了觀察轉錄效率改變的情形,我們培養兩個品系的果蠅,其一帶有標記基因 (target gene) 可影響外表型 (phenotype),其二帶有針對該基因的轉錄因子(tissue specific GAL4 line)。若需要進行實驗,便使兩品系交配而產生子代,並令標記基因已啟動的胚胎在不同溫度下發育,觀察發育環境溫度不同導致的外表型差異,我們由此評估溫度對蛋白質活性造成的影響。


實驗藥品 编辑

1.果蠅 (GMR-GAL4, UASG-dtlk, w1118)

2.解剖顯微鏡

3.果蠅培養基(已在指管內)

4.棉花棒

5.鑷子

6.麻醉劑 (Triethylamine)


步驟 编辑

前置作業

1. 兩種virgin females之採集 (UASG-dtlk, w11188),每天早上十點、下午四點、晚上十點各採集一次破蛹 (pupa) 而出的雌果蠅。區分雌雄果蠅可觀察性梳之有無、腹部體節的顏色,但最容易的分辨方法是觀察腹部末端的形狀,雌果蠅為尖型 (似鋼珠筆的筆尖)、雄果蠅為鈍狀 (似麥克筆的筆頭),但以觀察雄蠅外性器官為準。需志願者來收集virgin females和作交配。

2. 剛為成蟲的雌果蠅需經過六到八小時才具有交配能力,所以下午四點和晚上十點採集到的雌果蠅為virgin female,而早上十點採集的果蠅則必須經過挑選。

3. 果蠅剛破蛹時,外骨骼不夠堅實,因此形狀是塌扁的細長形,但接著果蠅會吸氣使腹部膨脹,頗具混淆視聽的效果,所以我們用二氧化碳將之麻醉,若它像氣球洩氣般塌掉,則表示外骨骼尚未硬化,是可接受的virgin female;另一個方法是觀察蛹糞,蛹糞是留在其消化到的廢棄物,從腹部的腹面看去有一個黑色的點,這蛹糞會在接下來的時間被排掉,所以保有蛹糞的果蠅亦可視為virgin female。

4. 採集GAL4+雄果蠅,區分方法同step 1。

實驗一

1.兩管已交配完畢的指管,兩組果蠅分別是:

實驗組:3 GAL4+ males × 10 UASG-dtlk females

對照組:3 GAL4+ males × 10 w1118 females

2. (實驗當天)將成蟲換到新的指管,舊管放置在22 ℃培養箱,新管放置在25 ℃培養箱。

3. (第二天)讓果蠅在25℃的環境下產卵一天後,將成蟲換到新的指管,舊管放回25 ℃培養箱,新管放置在29 ℃培養箱。

4. 第四天將29 ℃培養的成蟲倒到集屍瓶。

實驗二

1.七天後取出果蠅培養瓶,將新羽化的成蟲到新的指管裡面不含食物, 用棉花棒沾取麻醉劑Triethylamine,將果蠅培養瓶打開個小縫,插入棉花棒,等待3到5分鐘後,即可開始觀察被麻醉的果蠅,麻醉的有效時間大約是30分鐘到40分鐘。

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