FANDOM


目的 编辑

(1) 了解转化的概念,及其在分子生物学研究中的意义。

(2) 学习氯化钙制备大肠杆菌胜任细胞的方法。

(3) 学习将外源质体DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。

原理 编辑

转化(transformation)是将异源DNA 分子引入另一细胞品系,使受 体细胞获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、 基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株, 即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株,常用R-M-符号表示。受体 细胞经过一些特殊方法(如:电击法、CaCl2、RuCl 等化学试剂法)的 处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA 分子通过 的胜任细胞。在一定条件下,将外源DNA 分子与胜任细胞混合保温, 使外源DNA 分子进入受体细胞。进入细胞的DNA 分子通过复制表达 实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后 的细胞在选择性培养基中培养即可筛选出转化体(即带有异源DNA分 子的受体细胞,transformant)。

本实验以E. coli DH10B 菌株为体细胞,用CaCl2 处理受体菌使其 处于感受态,然后与pET-21b 质体共保温,实现转化。pET-21b 质体 携带有抗胺苄青霉素的基因,因而使接受了该质体的受体菌具有抗胺 苄青徽素的特性,常用Ampr 符号表示。将经过转化的全部受体细胞 经过适当稀释后,在含胺苄青霉素的平板培养基上培养,只有转化体 才能存活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗苄青霉素的能力而死 亡。

转化体经过进一步纯化扩增后,可再将转入的质体DNA 分离提 取出来,进行重复转化、电泳、电子显微镜观察及做限制性内切酶解 图谱等实验鉴定。

实验药品材料 编辑

一、实验材料:

(1) E. coli DH10B 受体菌: R-M-,Ampr。

(2) pET-21b 质体DNA:购买商品或实验室分离提纯所得样品。

二、试剂:

LB(Luria-Bertani)培养基的配制和胺苄青徽素贮存液的配制

1. 含抗生素的LB 平板培养基

胰蛋白胨(tryptone) 10 g

酵母浸膏(yeast extract) 5 g

氯化钠(NaCl) 10 g

洋菜胶(Agar) 15 g

用NaOH 调节至pH7.5,定量至1L。 将配好的LB 固体培养基高压灭菌后,冷却至60℃左右,加入 胺苄青霉素贮存液,使终浓度分别为50μg/ml 和12.5μg/ml,摇匀后 铺板。

2. 0.1M CaCl2 溶液

每100 ml 溶液含CaCl2(无水、分析纯)1.10 g,用无菌重蒸馏水 配制,过0.2μm 的filter,并分装后存于-20℃冰箱保存。

三、器材:

1.恒温培养箱

2.无菌操作台

3.分光光度计

4.离心机

5.微量分注器(pipetman)

6.微量离心管

步骤 编辑

A、转化

(1) 取200 μl 摇匀后的胜任细胞悬液(如是冷冻保存液,则需解冻后马 进行下面的操作),加入pET-21b 质体DNA 溶液(含量不超过50 ng, 体积不超过2 μl),此管为转化实验组。

★同时,做两个对照管。

a. 受菌体对照组:200 μl 胜任细胞悬液+2 μl 无菌蒸馏水。

b. 质体DNA 对照组:200 μl 0.1M CaCl2 溶液+2 μlpET-21b 质体DNA 溶液。

(2) 将以上各样品轻摇匀,冰上放置30 分钟后,于42℃水浴中保温2 分钟,然后迅速在冰上冷却3-5 分钟。

(3) 上述各管中分别加入300 μl LB 液体培养基,则总体积约0.5 ml, 该溶液称为转化反应原液。混匀于37℃水浴中温浴15 分钟以上(欲获 得更高的转化率,则此步也可振荡培养),使受体菌恢复正常生长状 态,并使转化体产生抗药性(Ampr)。

(4) 分别取适当稀释度的各样品培养液0.1-0.2 ml,接种于两种含抗 生素和不含抗生素的平板培养基上涂匀。 以上各步操作均需在无菌操作台中进行。

(5) 菌液完全被培养基吸收后,倒置培养皿,于37℃恒温培养箱内培 养24 小时,待菌落生长良好而又未相互重叠时停止培养,每组平行做 两份。

B、检出转化体和计算转化率

统计每个培养皿中的菌落数。

注意事项 编辑

为提高转化率,实验中要注意以下几个重要因素:

1. 细胞生长状态和密度

不要用已经过多次转接,及贮存在4℃的培养菌液,细胞生长密 度以每毫升培养液中的细胞数在5×107 个左右为最佳(可通过测定培 养液的A600 控制),密度不足或过高均会使转化率下降。

2. 转化的质体DNA 的品质和浓度

用于转化的质体DNA 应主要是共价闭环DNA(即covalenty closed circular DNA;cccDNA,又称超螺旋DNA),转化率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA 的量过多或体积 过大则会使转化率下降。

3. 试剂的品质

所用的试剂,如CaCl2 等,应是高品质的,且最好分装保存于干 燥的暗处。

4. 防止杂菌和其他外源DNA 的污染

所用器皿,如离心管分装用的微量离心管等,一定要干净,最好 是新的。整个实验过程中要注意无菌操作,少量其他试剂或DNA 的 污染都会影响转化率,或是转进了杂DNA。

您使用了广告屏蔽软件!


Wikia通过广告运营为用户提供免费的服务。我们对用户通过嵌入广告屏蔽软件访问网站进行了使用调整。

如果您使用了广告屏蔽软件,将无法使用我们的服务。请您移除广告屏蔽软件,以确保页面正常加载。