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目的 编辑

(1) 瞭解轉化的概念,及其在分子生物學研究中的意義。

(2) 學習氯化鈣製備大腸桿菌勝任細胞的方法。

(3) 學習將外源質體DNA 轉入受體菌細胞並篩選轉化體的方法。

原理 编辑

轉化(transformation)是將異源DNA 分子引入另一細胞品系,使受 體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、 基因工程等研究領域的基本實驗技術。

轉化過程所用的受體細胞一般是限制-修飾系統缺陷的變異株, 即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株,常用R-M-符號表示。受體 細胞經過一些特殊方法(如:電擊法、CaCl2、RuCl 等化學試劑法)的 處理後,細胞膜的通透性發生變化,成為能容許外源DNA 分子通過 的勝任細胞。在一定條件下,將外源DNA 分子與勝任細胞混合保溫, 使外源DNA 分子進入受體細胞。進入細胞的DNA 分子通過複製表達 實現遺傳信息的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化後 的細胞在選擇性培養基中培養即可篩選出轉化體(即帶有異源DNA分 子的受體細胞,transformant)。

本實驗以E. coli DH10B 菌株為體細胞,用CaCl2 處理受體菌使其 處於感受態,然後與pET-21b 質體共保溫,實現轉化。pET-21b 質體 攜帶有抗胺苄青黴素的基因,因而使接受了該質體的受體菌具有抗胺 苄青徽素的特性,常用Ampr 符號表示。將經過轉化的全部受體細胞 經過適當稀釋後,在含胺苄青黴素的平板培養基上培養,只有轉化體 才能存活,而未受轉化的受體細胞則因無抵抗苄青黴素的能力而死 亡。

轉化體經過進一步純化擴增後,可再將轉入的質體DNA 分離提 取出來,進行重複轉化、電泳、電子顯微鏡觀察及做限制性內切酶解 圖譜等實驗鑑定。

實驗藥品材料 编辑

一、實驗材料:

(1) E. coli DH10B 受體菌: R-M-,Ampr。

(2) pET-21b 質體DNA:購買商品或實驗室分離提純所得樣品。

二、試劑:

LB(Luria-Bertani)培養基的配製和胺苄青徽素貯存液的配製

1. 含抗生素的LB 平板培養基

胰蛋白腖(tryptone) 10 g

酵母浸膏(yeast extract) 5 g

氯化鈉(NaCl) 10 g

洋菜膠(Agar) 15 g

用NaOH 調節至pH7.5,定量至1L。 將配好的LB 固體培養基高壓滅菌後,冷卻至60℃左右,加入 胺苄青黴素貯存液,使終濃度分別為50μg/ml 和12.5μg/ml,搖勻後 鋪板。

2. 0.1M CaCl2 溶液

每100 ml 溶液含CaCl2(無水、分析純)1.10 g,用無菌重蒸餾水 配製,過0.2μm 的filter,並分裝後存於-20℃冰箱保存。

三、器材:

1.恆溫培養箱

2.無菌操作台

3.分光光度計

4.離心機

5.微量分注器(pipetman)

6.微量離心管

步驟 编辑

A、轉化

(1) 取200 μl 搖勻後的勝任細胞懸液(如是冷凍保存液,則需解凍後馬 進行下面的操作),加入pET-21b 質體DNA 溶液(含量不超過50 ng, 體積不超過2 μl),此管為轉化實驗組。

★同時,做兩個對照管。

a. 受菌體對照組:200 μl 勝任細胞懸液+2 μl 無菌蒸餾水。

b. 質體DNA 對照組:200 μl 0.1M CaCl2 溶液+2 μlpET-21b 質體DNA 溶液。

(2) 將以上各樣品輕搖勻,冰上放置30 分鐘後,於42℃水浴中保溫2 分鐘,然後迅速在冰上冷卻3-5 分鐘。

(3) 上述各管中分別加入300 μl LB 液體培養基,則總體積約0.5 ml, 該溶液稱為轉化反應原液。混勻於37℃水浴中溫浴15 分鐘以上(欲獲 得更高的轉化率,則此步也可振盪培養),使受體菌恢復正常生長狀 態,並使轉化體產生抗藥性(Ampr)。

(4) 分別取適當稀釋度的各樣品培養液0.1-0.2 ml,接種於兩種含抗 生素和不含抗生素的平板培養基上塗勻。 以上各步操作均需在無菌操作台中進行。

(5) 菌液完全被培養基吸收後,倒置培養皿,於37℃恆溫培養箱內培 養24 小時,待菌落生長良好而又未相互重疊時停止培養,每組平行做 兩份。

B、檢出轉化體和計算轉化率

統計每個培養皿中的菌落數。

注意事項 编辑

為提高轉化率,實驗中要注意以下幾個重要因素:

1. 細胞生長狀態和密度

不要用已經過多次轉接,及貯存在4℃的培養菌液,細胞生長密 度以每毫升培養液中的細胞數在5×107 個左右為最佳(可通過測定培 養液的A600 控制),密度不足或過高均會使轉化率下降。

2. 轉化的質體DNA 的品質和濃度

用於轉化的質體DNA 應主要是共價閉環DNA(即covalenty closed circular DNA;cccDNA,又稱超螺旋DNA),轉化率與外源DNA 的濃度在一定範圍內成正比,但當加入的外源DNA 的量過多或體積 過大則會使轉化率下降。

3. 試劑的品質

所用的試劑,如CaCl2 等,應是高品質的,且最好分裝保存於乾 燥的暗處。

4. 防止雜菌和其他外源DNA 的污染

所用器皿,如離心管分裝用的微量離心管等,一定要乾淨,最好 是新的。整個實驗過程中要注意無菌操作,少量其他試劑或DNA 的 污染都會影響轉化率,或是轉進了雜DNA。

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